Multidimensionale Einzelmolekül-Fluoreszenz-Spektroskopie Von Floureszenzmarkierten Biomolekülen - pocketboek

In den letzten dreizehn Jahren haben sich die Methoden zum Nachweis von einzelnen Molekülen rasant weiterentwickelt. Treibende Kraft sind dabei die vielfältigen Vorteile der Einzelmoleküldetektion gegenüber herkömmlichen Ensemble-Techniken im Hinblick auf die ultimative Empfindlichkeit und die Untersuchung heterogener Systeme. Durch die Charakterisierung einzelner Moleküle können Verteilungen ihrer Eigenschaften einfach bestimmt und Reaktionen zeitlich direkt verfolgt werden. Hieraus eröffnen sich zahlreiche interessante Anwendungsmöglichkeiten für die Charakterisierung biologisch relevanter Systeme, wenn die Biomoleküle mit geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden können. Ein weiterer wichtiger Fortschritt auf dem Gebiet der Einzelmolekülspektroskopie mit laserinduzierter Fluoreszenzdetektion stellt die Bestimmung molekularer Abstände mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen einem Donor- und einem Akzeptorfarbstoff dar. Diese besondere Technik steht jedoch gerade erst am Anfang ihrer Entwicklung. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung komplexerer Systeme gilt es, sowohl die Präzision der Messungen zu verbessern, als auch die Wechselwirkung zwischen Makromolekül und Fluorophoren in Betracht zu ziehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) in einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop zur Untersuchung einzelner frei in Lösung diffundierender Moleküle verwendet. Im Vergleich zu anderen Einzelmolekül-Meßverfahren besitzt die MFD-Technik dank des besonderen Detektions- und Analyseverfahrens einzigartige Vorteile, die sich auf die Multidimensionalität der Methode gründen. Dieser Begriff soll verdeutlichen, daß die gesamte Information der Fluoreszenz eines einzelnen Fluorophors vollständig erfaßt wird. Konkret können mit MFD die Fluoreszenzlebensdauer, -anisotropie und Intensität in zwei spektralen Bereichen zeitaufgelöst charakterisiert werden.